蛋白由若干氨基酸脱水缩合排列构成，含有一个游离的氨基（N端）和一个游离的羧基（C端）。C端与N端一样，在蛋白质分子结构分析中具有重要的地位，是蛋白质完整一级结构的必须信息，对C端序列进行测定具有重要的意义。

(资料图)

北京百泰派克生物科技有限公司基于CNAS/ISO9001双重质量认证体系，根据肽图分析（质谱法）原理，建立了针对于不同类别生物制品的蛋白C端序列分析服务，可实现对蛋白、抗体、疫苗、多肽、重组胶原蛋白等生物制品C端序列的测定。

技术原理

目前尚未开发出类似于Edman降解的C端序列测定技术，因此蛋白C端序列的确证服务仍然是以质谱平台为基础。根据靶蛋白理论序列信息选择互补性好的两种蛋白酶酶切蛋白，产生两个长度不同但是适宜离子化的C端肽段，经质谱检测，相互验证，最终确定蛋白C端序列。

附常见蛋白酶酶切条件及位点：

实验仪器

• 纳升级高效液相色谱仪：Easy-nLC 1200；

• 组合型四极杆-Orbitrap质谱仪：Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer。

案例示意

样品蛋白经过适合的蛋白酶酶切之后变成长度大多在6-28aa的肽段，进入质谱分析后产生的总离子流谱图如下：

样品总离子流谱图（TIC）

（横坐标为时间（min），纵坐标为相对信号强度）

通过一级质谱图可以得到完整肽段的分子量，mass=(m/z-1)*z

C端肽段一级质谱图

（横坐标为检测到的m/z值，纵坐标为相对信号强度）

二级质谱图得到的是肽段的碎片离子m/z值，完整肽段在质谱中从肽键位置被打碎为碎片离子，靠近肽段的N端的为b离子，靠近C端的为y离子（例如二级图中的肽段KTSTSPLVKSF, 二级碎裂之后，碎片离子K和TSTSPLVKSF分别为b1和y10离子，碎片离子KT和STSPLVKSF分别为b2和y9离子）。理论的碎片离子m/z与实际二级图中的检测值匹配到的越多，可信度越高。通过肽段二级碎裂片段信息确定C端肽段序列

肽段二级质谱图

（横坐标为检测到的m/z值，纵坐标为相对信号强度）

实际项目中会至少使用两种互补的蛋白酶对靶蛋白进行酶切，可以得到两条长度不同的C端肽段，通过对于两条C端肽段序列的相互验证，最终确定蛋白的C端序列信息。

常见典型问题

问题1：蛋白经过酶切后会在固定的位点断开，如何确定C端的肽段就是蛋白C端呢？

回答：数据分析的时候会挑选N端为酶切位点而C端不是酶切位点的肽段，保证肽段是酶切形成的而不是随机的杂质肽段，同时保证肽段末端与对比末端是统一的。

问题2：如果分析结果只有C末端为酶切位点的肽段，如何进步确认C端具体位置？

回答：这种结果通常是两种情况造成的。第一种情况是蛋白的C端正好是酶切位点，我们可以通过不同酶切同时分析排除这种情况。第二种是蛋白C端离该酶切位点很近或很远，酶切之后剩余片段太短或太长，碎裂情况太差，无法被分析软件识别到，我们可以建立一个梯度数据库，每个序列比上一下序列多一个氨基酸，利用梯度数据库重新比对分析。