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生物制药C端测序

2023-07-10 09:23:16来源:哔哩哔哩

蛋白由若干氨基酸脱水缩合排列构成,含有一个游离的氨基(N端)和一个游离的羧基(C端)。C端与N端一样,在蛋白质分子结构分析中具有重要的地位,是蛋白质完整一级结构的必须信息,对C端序列进行测定具有重要的意义。


(资料图)

北京百泰派克生物科技有限公司基于CNAS/ISO9001双重质量认证体系,根据肽图分析(质谱法)原理,建立了针对于不同类别生物制品的蛋白C端序列分析服务,可实现对蛋白、抗体、疫苗、多肽、重组胶原蛋白等生物制品C端序列的测定。

技术原理

目前尚未开发出类似于Edman降解的C端序列测定技术,因此蛋白C端序列的确证服务仍然是以质谱平台为基础。根据靶蛋白理论序列信息选择互补性好的两种蛋白酶酶切蛋白,产生两个长度不同但是适宜离子化的C端肽段,经质谱检测,相互验证,最终确定蛋白C端序列。

附常见蛋白酶酶切条件及位点:

实验仪器

• 纳升级高效液相色谱仪:Easy-nLC 1200;

• 组合型四极杆-Orbitrap质谱仪:Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer。

案例示意

样品蛋白经过适合的蛋白酶酶切之后变成长度大多在6-28aa的肽段,进入质谱分析后产生的总离子流谱图如下:

样品总离子流谱图(TIC)

(横坐标为时间(min),纵坐标为相对信号强度)

通过一级质谱图可以得到完整肽段的分子量,mass=(m/z-1)*z

C端肽段一级质谱图

(横坐标为检测到的m/z值,纵坐标为相对信号强度)

二级质谱图得到的是肽段的碎片离子m/z值,完整肽段在质谱中从肽键位置被打碎为碎片离子,靠近肽段的N端的为b离子,靠近C端的为y离子(例如二级图中的肽段KTSTSPLVKSF, 二级碎裂之后,碎片离子K和TSTSPLVKSF分别为b1和y10离子,碎片离子KT和STSPLVKSF分别为b2和y9离子)。理论的碎片离子m/z与实际二级图中的检测值匹配到的越多,可信度越高。通过肽段二级碎裂片段信息确定C端肽段序列

肽段二级质谱图

(横坐标为检测到的m/z值,纵坐标为相对信号强度)

实际项目中会至少使用两种互补的蛋白酶对靶蛋白进行酶切,可以得到两条长度不同的C端肽段,通过对于两条C端肽段序列的相互验证,最终确定蛋白的C端序列信息。

常见典型问题

问题1:蛋白经过酶切后会在固定的位点断开,如何确定C端的肽段就是蛋白C端呢?

回答:数据分析的时候会挑选N端为酶切位点而C端不是酶切位点的肽段,保证肽段是酶切形成的而不是随机的杂质肽段,同时保证肽段末端与对比末端是统一的。

问题2:如果分析结果只有C末端为酶切位点的肽段,如何进步确认C端具体位置?

回答:这种结果通常是两种情况造成的。第一种情况是蛋白的C端正好是酶切位点,我们可以通过不同酶切同时分析排除这种情况。第二种是蛋白C端离该酶切位点很近或很远,酶切之后剩余片段太短或太长,碎裂情况太差,无法被分析软件识别到,我们可以建立一个梯度数据库,每个序列比上一下序列多一个氨基酸,利用梯度数据库重新比对分析。

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